François Ier , en lutte avec Charles Quint passe diverses alliances, en particulier avec l’empereur turc Soliman le magnifique. Celui-ci cherche à s’emparer de Rhodes, état souverain chrétien.
Le siège décisif a lieu en 1522. Il dure cinq mois. La prise de Rhodes ne sera due qu’à la trahison du grand chancelier de l’Ordre. Impressionné par la résistance héroïque du grand maître Philippe Villiers de L’Isle-Adam, Soliman accorde libre passage aux chevaliers rescapés.
Emportant dans trente navires leur trésor, leurs archives et leurs reliques, les chevaliers quittent définitivement la Méditerranée orientale le 1er janvier 1523 avec 4000 autochtones qui refusent le joug turc… Les Hospitaliers entament alors une errance de sept années pendant lesquelles ils vont solliciter des royaumes occidentaux l’attribution d’une terre qu’ils pourront administrer de manière souveraine.
L’empereur Charles Quint, comprenant l’utilité que peut avoir un ordre militaire en Méditerranée face aux avancées ottomanes, confie à l’ordre l’archipel de Malte, dépendance du royaume de Sicile, par un acte du 24 mars 1530, faisant du grand maître de l’ordre le prince de Malte.
Etablis à Malte, les Chevaliers de l’ordre se consacrent de nouveau aux soins et à l’accueil des malades. Une « Grande Infirmerie » est bâtie en 1575. Elle devient en quelques années le plus grand hôpital européen avec plus de cinq cents lits individuels autour desquels se pressent médecins et chirurgiens venus de toute l’Europe. Une école de médecine et de pharmacie, une bibliothèque, la pratique pourtant interdite de la dissection permettent à la médecine de Malte de faire d’énormes progrès.
Parallèlement à leur vocation hospitalière, les chevaliers de Malte continuent à pratiquer la guerre maritime et surtout la guerre de course contre les corsaires barbaresques qui écument la méditerranée. La course permet à l’Ordre de s’enrichir et elle transforme les commanderies européennes en un système de bénéfices attirant ainsi les fils cadets de l’aristocratie.
Elle les fait souvent admettre dans l’ordre dès l’enfance afin qu’ils soient mieux placés dans la « course aux commanderies ». Les novices viennent accomplir leurs 4 « caravanes » c’est à dire un service sur les galères de l’ordre de Malte. Ceux-ci, une fois munis d’une commanderie, ou plutôt de ses revenus, servent leur roi, souvent dans la marine.